جنتامایسین از خانواده آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزید است و به باکتری های حساس حمله می کند. این دارو با اتصال به زیرواحدS ۳۰ ریبوزوم باکتری، سنتز پروتئین های ضروری برای رشد و بقا باکتری را مهار می کند. در نتیجه باکتری نمی تواند پروتئین های لازم برای تقسیم و تکثیر را تولید کند و در نهایت رشد آن متوقف می شود.
علاوه بر مهار سنتز پروتئین، جنتامایسین باعث آسیب به غشای سلولی باکتری نیز می شود و نفوذپذیری غشاء را افزایش می دهد. این اثر ترکیبی باعث مرگ سریع باکتری ها می شود و عفونت های شدید باکتریایی را کنترل می کند. جنتامایسین به ویژه در برابر باکتری های گرم منفی بسیار مؤثر است و در درمان عفونت های پیچیده و تهدید کننده زندگی کاربرد فراوان دارد.